防御素的研究进展

    发布时间: 2010-07-24 15:12 浏览次数:

    余兴邦1 ,郭锁链1 ,乌翠兰2 ,李大竣1 ,呼格吉勒图1 ,鄂 优1

    1. 内蒙古自治区呼伦贝尔市兽医工作站,内蒙古海拉尔021008 ;
    2. 内蒙古自治区鄂尔多斯市乌审旗畜牧局,内蒙古乌审旗017300)
    中图分类号:S852. 4 ;Q291 文献标识码:A 文章编号:100725038 (2006) 0820047205
     
    摘 要:防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽,是内源性抗微生物肽中的一个大家族。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异,可分为α2防御素、β2防御素、θ2防御素、昆虫防御素和植物防素5 种类型。防御素是由29 个~54 个氨基酸残基组成的小分子肽,具有广泛的生物学活性。防御素分子可以直接作用并杀死细菌、真菌和病毒等病原微生物,除此之外,防御素还具有细胞毒、免疫调节以及创伤和神经损伤的修复等多种生物学活性。文章概述了防御素的分子结构特征、分布、生物学活性及国内外研究概况。
     
    关键词:防御素;进展
     
    自然界中各类生物物种都具有一套有效的防范机制以适应外界环境。30 多年前, Zeya 首次在老鼠和豚鼠的多形核中性粒细胞的胞质颗粒中发现了一种富含精氨酸和半胱氨酸的阳离子蛋白,并命名为“溶酶体阳离子蛋白”。20 世纪80 年代中期,美国加里福尼亚大学Ganz 研究组在研究吞噬细胞非依赖氧杀菌机制过程中,又从兔和人中性粒细胞胞浆颗粒中发现一系列一级结构相似的小分子阳离子肽,由于其广谱的抗微生物活性而首次以“防御素(defensins) ”一词作为这类肽的命名。之后不久,法国学者Hoffmann 等于1989 年报道在昆虫中分离到与兔子肺吞噬细胞防御素分子同源的防御素。1992 年, 比利时学者Terras 等报道从小萝卜种子中分离到一个新的分子质量为5 ku 、富含半胱氨酸的抗真菌蛋白家族成员AFPs ( Antif ungal pro2teins) 。迄今为止,已从不同种属动物的中性粒细胞、小肠潘氏( Paneth) 细胞、哺乳动物和禽类多种器官的上皮细胞及昆虫和植物中发现了100 多种不同的防御素分子, 它们是一类最大的内源性抗微生物肽家族成员。
     
    1  防御素的分类
    防御素是一类在生物界广泛存在的小分子抗菌肽。它的特点是由29 个~54 个氨基酸残基组成,包括6 个~8 个保守的半胱氨酸,并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的β2片状结构,有的防御素(如昆虫和植物防御素) 还含有一个α2螺旋结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为α2防御素、β2防御素、θ2防御素、昆虫防御素和植物防御素5 种类型。
     
    2  防御素的分子特征
    成熟的防御素是一类分子质量为3. 5 ku~6 ku的非糖基多肽,一般富含精氨酸,带正电荷,有6 个~8 个保守的半胱氨酸残基,且它们在分子内形成二硫键,分子内二硫键对于维持防御素结构的稳定性具有重要作用,并且是防御素抗微生物活性和细胞毒效应的重要结构基础。
     
    2. 1  α2防御素
    成熟的α2防御素是由29 个~36 个氨基酸残基组成的短肽,分子内含有6 个保守的半胱氨酸形成的3 对二硫键。通过二维核磁共振研究证实,3 对二硫键的连接位置分别为Cys12Cys6 ,Cys22Cys4 ,Cys32Cys5 连接,其中Cys1~Cys6 对二硫键连接N端和C 端的半胱氨酸形成分子大环,所以α2防御素的一级结构一般为圆形。
    2. 2  β2防御素
    成熟的β2防御素是由38 个~42 个氨基酸残基组成,其分子内包含在特定位置上的6 个保守的半胱氨酸和其他一些决定β2防御素结构和功能的保守氨基酸如G10 ,G25 , T26 ,但与α2防御素不同的是6 个半胱氨酸形成的3 对二硫键的连接位置不同,β2防御素分子中二硫键是由Cys12Cys5 , Cys22 Cys4 ,Cys32Cys6 方式连接[1 ] 。
    2. 3  θ2防御素
    θ2防御素是最新发现的一类防御素,其成熟肽是由18 个氨基酸残基组成,其分子结构呈环行,也含有3 对二硫键,它是在成熟肽加工过程中由其前原肽RTD1a 和RTD1b 的成熟肽部分截短后连接形成[2 ] 。
    2. 4  昆虫防御素
    成熟的昆虫防御素大多由34 个~43 个氨基酸残基组成。昆虫防御素一个明显的分子特征是其分子链中在Cys23 与Cys24 之间有3 个保守的Gly ( G)残基。此外,它们分子内的3 对二硫键配对也与α2和β2防御素截然不同,分别为Cys212Cys24 ,Cys222Cys25 ,Cys232Cys26 。
    2. 5  植物防御素
    植物防御素由45 个~54 个氨基酸残基组成,含有4 对二硫键,二硫键的配对连接方式为Cys212Cys28 , Cys222Cys25 , Cys23 2Cys26 , Cys242Cys27 , 其中3 个二硫键形成的位置是处于整条多肽链的疏水核心。
     
    3  防御素的分布
    3. 1  α2防御素
    最先从哺乳动物中性粒细胞及小肠隐窝潘氏细胞中发现的防御素被称为经典防御素,即α2防御素。截止目前,α2防御素只发现于哺乳动物体内,即主要分布于人、大鼠、豚鼠、兔、恒河猴的中性粒细胞和人、小鼠、恒河猴的小肠潘氏细胞内。在中性粒细胞内,α2防御素含量丰富,是中性粒细胞非赖氧杀菌机制的重要组成部分。在人的中性粒细胞中发现有4 种α2防御素,即HNP21~4 ,它们存在于中性粒细胞的胞质颗粒内,研究发现HNP21~3 还存在于发炎的口腔唾液、结膜、泪腺及眼泪中。在兔的中性粒细胞中发现有6 种α2防御素,即
    RabNP21~2 ,RabNP23a ,RabNP23b ,RabNP24~5 ,其总量占细胞蛋白质总量的15 %~20 %。在兔的巨噬细胞中含有两种α2防御素,即MCP21~2 ,但其表达因组织起源及动物年龄的不同而异[3 ] 。在大鼠的中性粒细胞中有RatNP21~4 共4 种α2防御素。在豚鼠的中性粒细胞中有GPDEF21~2 两种α2防御素。斑点杂交显示,中性粒细胞α2防御素主要表达于骨髓。在小鼠、猪、马、山羊和绵羊的中性粒细胞中尚未发现有防御素的表达。而在牛和鹿的中性粒细胞中表达的是β2防御素[4 ] 。在人的小肠隐窝潘氏细胞内发现有两种α2防御素HD25~6 ,它们储存于小肠潘氏细胞颗粒内,另外发现HD25 还存在于健康女性的阴道和子宫颈阴道部,以及发炎的输卵管内和发炎大肠的潘氏细胞内。在小鼠小肠潘氏细胞内发现至少有19 种α2防御素,又称隐窝素(cryptdins) ,其中Cryptdin21~6 的肽被纯化为同性质的物质,其余的肽由于其产量很少而未得到纯化产物。在恒河猴的小肠潘氏细胞内发现有6 种α2防御素,即RED21~6[5 ] 。在正常大鼠小肠潘氏细胞中未发现有α2防御素的表达,但在出血性休克的大鼠小肠潘氏细胞内发现有α2防御素表达,称RD25 。通过原位杂交、免疫荧光定位和抗原抗体免疫反应试验证明小鼠、恒河猴、人的小肠潘氏细胞α2防御素存在于潘氏细胞分泌颗粒内和肠腺的隐窝腔内,从而证明小肠潘氏细胞α2防御素的释放是通过潘氏细胞脱颗粒而实现的。所以,小肠潘氏细胞α2防御素可以通过冲洗小肠肠腔而得到。
     
    3. 2  β2防御素
    1991 年Diamond 首次从牛的气管内发现了另外一种防御素,分子内亦含有6 个保守的半胱氨酸残基, 但6 个保守的半胱氨酸形成的3 个链内二硫键的连接方式与α2防御素有所不同, 因此命名为β2防御素。发现β2防御素主要分布于人、鼠、牛、羊、猪、骆驼及鸡和火鸡的多种器官上皮细胞内,此外,在牛和鹿的中性粒细胞以及鸡和火鸡的异嗜性白细胞内也有β2防御素的分布。人的β2防御素有hBD21~3 , hBD21 分布很广。最初由Bensol 等在肾病病人的血液过滤液中分离出微量的小分子肽hBD21 ,接着又发现人的尿液中含有hBD21 ,并通过原位杂交将hBD21 的mRNA 定位于人的肾脏和女性的生殖管道的上皮中。后来又发现在人的乳汁、牙龈组织、烧伤的上皮组织、气管、肺、肠、胰腺和肝脏中也存在β2防御素hBD21 。hBD22起初是从患牛皮癣病人的皮肤中分离得到,后来又发现在气管、正常皮肤和肺组织中也有hBD22的表达, 研究发现在人的免疫细胞内也有hBD21 和hBD22[6 ] ; hBD23 主要分布于心脏、骨骼肌、胎盘、食道、气管、口腔黏膜和皮肤。小鼠的β2防御素有mBD21~6 和大鼠的β2防御素rBD21~2 ,它们主要分布于肺、气管、肾脏和雄性生殖管道内[7 ] 。
    研究表明人和鼠的雄性生殖道内大部分β2防御素的表达是受雄激素调节的,即在性成熟期表达量增加[8 ] 。在狗体内有3 种β2防御素存在即cBD21~3 ,cBD21 主要表达在睾丸,在肺和肠管内有少量的表达,cBD22 和cBD23 只特异性表达在睾丸[9 ] 。特异性表达在生殖道内的防御素不仅有助于其先天性宿主防御,还具有参与其他生理过程的复杂功能。牛的β2防御素最初是从牛的气管黏膜上皮细胞中发现,被称为气管抗微生物肽TAP , TAP 也是发现的第一个β2防御素。后来又发现牛舌抗微生物肽LAP 和肠β2防御素EBD ,LAP 分布于牛舌的鳞状上皮细胞、呼吸道、胃肠道、结膜和泌尿生殖道以及脑和胎盘, EBD 主要分布于牛的远端小肠和结肠。在牛的中性粒细胞中发现了13 种β2防御素即BN2BD21 ~ 13 。另LAP , TAP , BNBD23 , BNBD29 和BNBD212 在牛的乳腺组织也有表达[10 ] 。在水牛的回肠内发现有β2防御素的存在,其氨基酸和核苷酸序列均与LAP 最接近[11 ] 。在绵羊体内发现有两种β2防御素存在,即sBD21~2 ,通过RT2PCR 检测显示sBD21 mRNA 表达较广,即在气管和整个消化道都有sBD21 mRNA 表达,而sBD22 的mRNA 只表达于舌和远端回肠。在山羊体内也发现两种β2防御素,即GBD21~2 ,GBD21 主要分布于舌和呼吸道,GBD22 分布于整个肠道。猪的β2防御素pBD21 广泛分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、心、肝、肾、脑、皮肤、肌肉、睾丸、膀胱、脐带及骨髓等器官内,但通过Nort hern blot 杂交显示pBD21 在猪舌及口腔黏膜内的表达量最丰富,且通过免疫组化研究显示pBD21 集中表达在舌背角化的丝状乳头层的0. 1 mm 厚度区域和口腔黏膜表面的鳞状细胞层,推测该处的防御素组成一个抵御进入口腔内的病原微生物的屏障。骆驼的β2防御素caBD21 主要分布于骆驼的消化道、呼吸道和泌尿生殖道内[12 ] 。
     
    在禽类中发现的防御素均为β2防御素。Evans首次从鸡和火鸡的异嗜性白细胞中分别纯化得到鸡的β2防御素Gal21~2 以及火鸡的β2防御素THP21~3 。Gal21a 是从鸡的异嗜性白细胞中纯化得到与Gal21极为相似的β2防御素,后来又在气管的上皮组织中发现有Gal21a 的表达,但这不能排除是从白细胞而来。研究发现Gal21 , Gal21a , Gal22 主要表达在
    鸡的骨髓,在肺中有少量的表达[ 13 ] 。Gal23 在骨髓的表达量少,而在鸡的舌、腔上囊和气管中大量表达,在皮肤、食管和气囊有中等量的表达,在大肠、肾、卵巢中有较弱的表达。由此可见,Gal21 ,Gal21a ,Gal22 的表达局限于骨髓,而Gal23 广泛表达于非骨髓细胞。GPV21 表达在火鸡的气管上皮组织内,与鸡的Gal23 一样是表达在上皮组织内的β2防御素。
    在鸵鸟的异嗜性白细胞中分别纯化得到β2防御素Osp21~4[ 14 ] 。
     
    企鹅的β2防御素Sp he21 和Sp he22 存在于企鹅的胃内,其浓度在食物储存期比消化期明显增高。所以企鹅在食物缺乏期其胃内容物可保存至少两周不变质。这表明Sp he21 和Sp he22 在企鹅的胃内容物中起到抗微生物的作用。从以上可以看出,α2防御素主要参与哺乳动物全身和小肠的防御功能,而β2防御素主要保护哺乳动物和禽类上皮细胞和黏膜免受感染
     
    3. 3  θ2防御素
    θ2防御素仅发现存在于恒河猴的中性粒细胞和单核细胞胞质颗粒内。
     
    3. 4  昆虫防御素
    昆虫防御素大量存在于昆虫血淋巴液中,该类防御素主要是通过对昆虫脂肪体的病变方式(如细菌感染) 被诱导产生并在昆虫血淋巴液中分泌。至今已在昆虫纲中发现了30 多种防御素,这些昆虫包括双翅目、膜翅目、毛翅目、半翅目、蜻蜓目。
     
    3. 5  植物防御素
    植物防御素首先是从小麦和大麦谷物中被抽提得到的。植物防御素大多来源于单子叶和双子叶植物种子,在某些植物叶片、马铃薯块茎和豌豆荚中也分离到该类防御素。植物防御素在植物体内常常定位于病原菌最先接触的部位或入口,如外缘细胞层,或者是病菌扩展的通道, 这与其生物学功能是相一致的。
     
    4  防御素的生物学活性
    4. 1  抗细菌作用
    体外试验显示α2防御素、β2防御素具有广谱的抗菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌、某些真菌、梅毒螺旋体和钩端螺旋体、分支杆菌等均具有很强的抗菌活性。相对而言,它们对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌有更强的杀伤力,这可能是革兰氏阴性菌的细胞壁有碍于防御素接触细胞膜。昆虫防御素可以抗革兰氏阳性菌而对革兰氏阴性菌几
    乎无作用。植物防御素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有微弱的抑制作用。昆虫缺乏获得性免疫系统的成分,所以,作为先天性免疫的防御素就显得尤为重要。其抗菌机制可以概括为:首先带正电荷的防御素分子以单体的形式与靶细胞膜带负电荷的磷脂头部结合,呈“地毯”
    状散布于靶细胞膜表面,这样就中和了磷脂的阴离子性,从而破坏了磷脂双分子层的完整性,引起靶细胞膜出现裂隙,允许离子和大分子物质通过靶细胞膜,最终使靶细胞死亡[ 15 ] 。
    Thevissen 等认为植物防御素在植物病原菌细胞膜上的受体分子能起固定凹的作用,可以将植物防御素直接插入细胞膜内或转运到细胞膜内,在植物防御素进入细胞膜内的过程中,伴随着的是细胞膜正常结构的破坏和膜的穿透性能的改变。
     
    4. 2  抗真菌作用
    植物防御素能广泛抑制真菌的的生长,被认为是真菌生长的有效抑制剂。Broekaert 等曾观察Rs2AFP1 和Rs2AFP2 对真菌生长的抑制作用,发现在仅含1μg/ mL 低剂量浓度的防御素存在条件下即可形成明显的抑菌圈。α2防御素和β2防御素也都有强的抗真菌作用,
    有试验观察到RabNP21 和RabNP22 均可在数分钟之内以相当低的浓度杀灭真菌白假丝酵母
    ( Can di da albicans) ,另有试验证明,牛的β2防御素TAP、LAP 对白假丝酵母有抑制作用。企鹅β2防御素Sp he22 可明显抑制真菌如白假丝酵母、热带白假丝酵母、红色面包菌( Neuros pora crassa) 和烟曲霉菌( As pergi l l us f umi g at us) 的生长。研究表明,昆虫防御素对真菌无作用。
     
    4. 3  抗病毒作用
    许多α2防御素如RabNP21~2 、HNP21~3 、大鼠RatNP21 、豚鼠GPDEF21 等已被证实对病毒具有杀伤作用。这些防御素对单疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒( HIV) 等衣壳病毒有明显的杀伤力,但对无衣壳病毒、呼肠病毒和艾滋病毒群却无效。人的β2防御素hBD22 和hBD23 能有效地抑制口腔内艾滋病病毒的感染, hBD22 除了直接灭活HIV 外,还可以抑制HIV 在细胞内的复制[16 ] 。α2防御素和β2防御素对病毒有抑制作用,而其他几类防御素对病毒是否具有抑制作用未见报道。
     
    4. 4  细胞毒作用
    在体外试验研究中,观察纯化的防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的作用情况,发现防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞具有毒性作用,并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。
     
    4. 5  其他生物活性
    防御素除了具有抗微生物活性和细胞毒活性外,还具有免疫调节、激素调节,以及对炎症、创伤及神经损伤的修复等作用[ 17 ] 。
     
    5  展望
    防御素特殊的抗性机理,即主要作用于病原微生物的细胞膜,使病原微生物不易对其产生抗性,而传统的抗生素主要作用于微生物的酶,酶基因的突变就会使靶细胞对其产生抗性。此外,防御素还具有十分广泛的抗性谱,可抗细菌、真菌、有囊膜病毒,甚至对支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性细胞(如肿瘤细胞) 和艾滋病病毒也有杀伤作用。因此,可将防御素作为“超级”抗生素发挥其强效、广谱的抗微生物感染的作用。
     
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    Advance in Defensins
    YU Xing2bang1 ,GUO Suo2lian1 ,WU Cui2lan2 ,L I Da2jun1 ,HU Ge J i2le2 t u1 ,E You1
    (1. Hulunbeier Veterrinary S tation , Hai laer , I nner Mongolia ,012008 , China;
    2. Wushen A nimal Husbandry B ureau of Eerduosi ,Wushen , I nner Mongolia ,017300 , China)
    Abstract :Defensins , a kind of endogenous antimicrobialionic peptides , contain rich cysteine and dist ribute abroad in t he kingdoms of animal and plant . Defensins are a big family among endogenous antimicrobial peptides. According to t he differences of t he position and connect manner of cysteines , the property of pre2 cursors , t he position of expression , defensins are devided into five subfamilies :α2defensin ,β2defensin ,θ2
    defensin , insect defensin and plant defensin. Defensins are small peptides comprised of 29~54 amino acid residues and have extensive biological activities. Defensins can kill directly microbial organisms as bacteria , fungi and viruses. Beside their direct antimicrobial f unction , defensins have multiple roles as cytotoxic function , immune induction , wound healing and injured nerve restoring. The general characteristics of mo2
    lecular st ructure ,dist ribution , and antimicrobial activities of defensins in China and abroad were summarized.
    Key words : defensins ;advance