防御素的研究进展和应用前景

    发布时间: 2010-07-24 15:06 浏览次数:

    近年来,在植物、昆虫、两栖类、鸟类和哺乳动物体内发现了一组具有抵抗外界微生物侵害的小分子多肽,称为防御素(defensins)。自 1984 年从人中性粒细胞分离出HNP123 以来,已有数十种防御素陆续被发现或报道[1]。防御素具有十分广泛的抗菌谱,对细菌、真菌、病毒等多种微生物都具有杀伤作用,尤其是哺乳动物防御素,除了对细菌、真菌、被膜病毒具有杀伤作用外,还能杀伤支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性肿瘤细胞。由于防御素具有众多的生物活性,因此对于它们的研究目前也越来越受到人们的广泛关注。现本文就防御素的结构与类型、生物活性、应用及基因工程制备做一综述。
     
    1 防御素的结构与类型
    防御素是富含精氨酸残基的阳离子多肽,一般由 18 ~54 个氨基酸组成,相对分子质量为 4000 ~ 6000 左右,分子中含有 6 ~ 8 个半胱氨酸残基,形成 3 ~ 4 对分子内二硫键,并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的β-片状结构,而某些防御素(如昆虫和植物防御素)还含有一个 α-螺旋结构。分子内二硫键对于维持防御素的结构稳定性具有重要作用,也是防御素抗微生物活性和细胞毒效应的重要结构基础。
     
    根据分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质以及表达位置的差异,防御素可分为 α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素 5 种类型。现已发现6 种人 α-防御素,包括髓源性的 HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4 和肠源性的 HD-5、HD-6,而人 β-防御素包括HBD-1、HBD-2、HBD-3、HBD-4、HBD-5 及 HBD-6[2]。
     
    2 防御素的生物活性
     
    2.1 抗菌作用
    防御素能有效地杀灭革兰阴性细菌和革兰阳性细菌。在体外浓度为 10 ~ 100 mg/L 的防御素即对多种细菌具有杀伤作用,而防御素在中性粒细胞中的浓度为 g/L 级,远远超过上述数值,这表明在体内防御素可能具有更强的杀菌活性,目前研究发现防御素对革兰阳性细菌的杀伤能力明显要强于革兰阴性细菌[3]。在体外,HBD-2 对大肠杆菌的半数致死量(LD50)为 0.46 nmol/ml,最小抑菌浓度(MIC)为 15 μg/ml,而对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的 MIC 为62 μg/ml[4]。体外实验证明大多数防御素的 MIC 范围为0.5 ~ 10 μmol/L[5]。
     
    植物防御素能广泛抑制真菌生长,被认为是真菌生长的有效抑制剂。观察抗真菌 r-硫堇蛋白 Rs-AFP1 和 Rs-AFP2对真菌生长的抑制作用,发现在仅含 1 μg/ml 低浓度防御
    素的条件下即可形成明显的抑菌圈[6]。α-防御素和 β-防御素也都具有较强的抗真菌作用,兔 α-防御素 RabNP-1 和RabNP-2 均可在数分钟之内以相当低的浓度杀灭白假丝酵母菌。但昆虫防御素对真菌则无抑制作用。目前,防御素的抗菌机制还不十分明确,通常认为其通
     
    过破坏微生物细胞膜而发挥杀伤作用,具体作用机制可能与电压依赖性膜通道的形成有关[7],细胞膜上多个防御素分子聚集形成孔隙或通道,使正常情况下处于细胞外的离子、多
    肽等流入细胞内,而细胞内重要的盐类、大分子等泄漏到细胞外,最终导致不可逆性菌体死亡[8]。另外,防御素的杀菌活性还受盐离子浓度的影响。除 θ-防御素外,α-防御素和β-防御素在 150 mmol/L 的 NaCl 浓度状态下其抗菌活性将会降低[5]。
     
    2.2 抗病毒作用
    防御素能杀灭一些被膜病毒,如 HIV、疱疹病毒、水泡型口炎病毒,但对无衣壳病毒却无效。θ-防御素还具有抗滤过性病原体和抗毒素作用。体内实验显示,防御素可延缓或根除兔梅毒病,并使兔牙周炎龈下菌群恢复正常[9]。防御素主要通过与病毒外壳蛋白结合从而导致病毒丧失生物活性,这一特殊作用机理也使得微生物不易对其产生抵抗性。防御素可直接抑制病毒,对病毒的抑制程度依赖于防御素浓度以及分子内二硫键的紧密程度,其抗病毒功效同样受时间、pH 值、离子强度和温度等因素的影响,在中性及低离子强度条件下,防御素具有较强的抗病毒活性[10],而在实验体系中加入血清或血清蛋白则可大大削弱防御素的抗病毒功效。
     
    2.3 细胞毒作用
    防御素对正常和恶性哺乳动物细胞都表现出非特异性的细胞毒作用,并且对人淋巴细胞及实体瘤细胞的细胞毒作用更为显著,尤其对抗 TNF 的 U9TR 细胞、抗 NK 细胞细胞毒因子的小鼠淋巴瘤 YAC-1 细胞和人组织细胞淋巴瘤 U937 细胞具有杀伤性。在体外,HNP 可抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶的活性,HNP 的细胞毒活性部分依赖于靶细胞膜脂质成分的代谢活性,它还可以与过氧化氢酶协同诱导细胞毒作用。体外观察纯化防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的杀伤作用,发现防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞均具有细胞毒作用,并且这
    种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关[6]。
     
    2.4 免疫调节作用
    防御素不仅可以直接抵抗病原微生物,而且还具有免疫调节作用。人、鼠、猪、兔的中性粒细胞防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒并释放组胺[11]。β-防御素还能通过与人趋化因子受体 6(CCR6)结合从而吸引不成熟的 DC 和 Tm 至炎症部位,激活细胞免疫和体液免疫。此外,防御素还可以直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚。
     
    2.5 趋化作用
    防御素的趋化作用是指防御素能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、气管上皮细胞等细胞表面受体从而启动获得性免疫系统,并将先天性免疫和获得性免疫有机连接的机制。现已证明一些 α-防御素、β-防御素对 T 细胞、单核细胞以及未成熟的 DC 具有趋化活性,可诱导单核细胞和上皮细胞产生细胞因子[12]。
     
    3 防御素的应用
    3.1 在医学中的应用
    3.1.1 防御素与口腔黏膜疾病的关系
    作为机体天然免疫的重要组成部分,防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用,与多种口腔黏膜疾病(口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔念珠菌病等)关系密切[2]。现今关于这方面的研究尚处于起步阶段,主要以体外实验为主,其作用机制也多为推测,而有关防御素在体内的具体作用、有无毒性或其他不良反应等方面的研究甚少,还需进一步全面多层次的研究探讨,以阐明防御素在口腔黏膜疾病发生发展过程中的具体作用及其机制,为口腔黏膜疾病防治提供新的策略。
     
    3.1.2 防御素与炎症性肠病的关系
    克罗恩病(CD)是一种严重的肠道慢性炎症性疾病,病变部位可发生于消化道的任何部位,病变形式多样,其发病是遗传因素与环境因素共同作用的结果。肠道防御素是机体抵御外源性致病因子的重要屏障,而克罗恩病患者肠道防御素表达水平却存在着较大差异。回肠段病变的克罗恩病患者,回肠潘氏细胞防御素HD-5、HD-6 的表达较正常人和非回肠段病变克罗恩病患者明显降低,这种变化与 NOD2 基因突变密切相关;结肠组织活检发现无 NOD2 基因突变的克罗恩病患者结肠组织HD-5、HD-6 的表达水平反而增高,而 HD-5、HD-6 水平降低将影响肠道黏膜的天然屏障作用,导致黏膜细菌附着引发进一步损害[13]。
     
    以往认为溃疡性结肠炎(UC)在欧美国家比较多见,但近年来中国文献报道的病例数也显著增多[14]。UC 病变主要累及结肠,正常人结肠黏膜很少表达 HD-5 和 HD-6,而UC 患者结肠上皮细胞中 HD-5 和 HD-6 mRNA 的表达水平显著高于正常人,且 HD-6 的表达还具有特异性,即在非感染性的结肠炎组织中表达并不明显。HBD-1 在肠道上皮细胞呈持续性表达,且不受外界因子影响,具有基础防御功能。但应用实时 PCR 技术检测发现 UC 和克罗恩病结__肠黏膜组织 HBD-1 基因表达水平均有所降低,这将可能促使肠道黏膜抗菌活性下降,从而导致细菌入侵机体引发炎症反应[13]。在 UC 患者的病变结肠组织中,HBD-2 可被诱导性表达,而 HBD-3 的表达水平和 HBD-2 存在一定的相关性,其在 UC 时表达亦有明显增加[15]。此外,HBD-4 mRNA的表达水平在 UC 肠上皮细胞中也明显增高。
     
    3.1.3 防御素与慢性阻塞性肺部疾病的关系
    慢性阻塞性肺部疾病(COPD)是一种以气道受限为特征的慢性气道炎症性疾病,患病率及病死率均较高,其中呼吸道感染是COPD 发病及加剧的一个重要因素。HBD-2 与呼吸系统疾病关系紧密,在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究证实,HBD-2 的产生或作用被抑制后,机体将发生肺部感染[16],据此推测人为补充外源性防御素可能会阻止细菌的定植和感染的发生。已有研究证实,重组 HBD-2 对肺损伤具有保护作用,可减少绿脓杆菌感染大鼠肺组织的菌落数[17]。COPD 患者存在气道、肺实质和肺血管炎症,而肺上皮细胞中高表达的 HBD-2 能通过对肺部炎症因子的调节,阻止全身性炎症反应(SIRS)甚至多器官功能衰竭(MODS)的发生发展。此外,重组 HBD-2 还可调控脓毒症诱发的肺组织细胞的过度凋亡,从而减轻肺组织损伤,保护肺功能[18]。
    3.1.4 防御素的临床药用研究
    防御素抗菌谱广泛,作用机理特殊,微生物不宜产生抗药性,因此具有很大的药用潜
    力。目前已进入临床试验阶段的防御素主要有细菌素、源于蛙马盖宁的 MSI-78 及源于猪 protegrin 的 IB-367。对926 例患者局部感染治疗的临床试验结果显示,MSI-78 对糖尿病患者足溃疡的疗效显著,且副作用较小;在系统感染治疗中,人中性粒细胞抗菌蛋白衍生物 BPI 作为一种注射药物已进入临床 III 期试验,结果显示其对脑膜炎奈瑟球菌的疗效显著[19]。
     
    3.2 在食品中的应用
    防御素具有良好的热稳定性,作为食品防腐剂可用于热加工食品的防腐保鲜,此外,它还可被用于防止巴氏杀菌后的再污染。
     
    3.3 在畜牧业中的应用
    抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡,药物残留也影响了畜产品的品质和人类健康,而来源于哺乳动物的防御素相对分子质量较小,热稳定性和水溶性均较好,在肠道内几乎不被吸收,仅在消化道内发挥作用,动物采食后在体内一般无残留。利用基因工程方法生产环保型防御素饲料添加剂或通过日粮添加,都可调控防御素基因的表达并实现其功效。
    通过对动物防御素基因等位变异和表达的分析,育种学家试图将防御素基因作为抗病育种的候选基因,从而选择对乳房炎等疫病具有高抗性的品系或群体。Swanson 等[20]研究发现牛乳中的体细胞数和牛舌黏膜上皮细胞中舌抗菌肽(LAP)的表达呈正相关;原位杂交实验也表明舌抗菌肽mRNA 可在乳腺上皮组织中表达。这预示着舌抗菌肽参与了乳房炎的先天性免疫,为奶牛乳房炎的预防和治疗提供了__重要依据。
     
    3.4 在农业中的应用
    防御素在农业中可用于农作物抗病育种研究,该研究主要是寄希望建立防御素生物反应器,大量生产并提纯防御素蛋白,以便培育抗性新品种。已有研究者将兔防御素 NP-1转入小麦植株,田间抗病虫鉴定结果显示小麦对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性均有较大提高[21]。而将兔防御素 NP-1基因构建至植物表达载体中获得转基因番茄植株的抗病实验结果表明,其对番茄青枯病具有抗性,为番茄的抗病育种工作奠定了基础[22]。
     
    4 防御素的基因工程制备
    防御素主要可通过 3 条途径获取:从细胞或体液中提取、化学合成、重组表达与纯化。防御素在组织中的表达量极少,纯化工艺的难度与成本也较高,因此基因工程制备无
    疑是大量生产防御素的首选方法。
     
    4.1 原核细胞表达
    获得高效表达选择合适的表达宿主菌是关键步骤之一。其中大肠杆菌 E.coli BL21 菌株因缺失 lon 和 ompT 蛋白酶,成为防御素重组表达的首选菌种[23]。一般选用 trxB 和gor 基因突变菌株作为表达宿主菌,可极大地提高可溶性蛋白的表达水平和生物活性。此外,防御素对宿主细胞还具有潜在的毒害作用,因此应尽量选择具有高度抑制性和诱导性的启动子,选用融合表达形式,要求很低的本底表达以减少对宿主细胞和表达水平的不利影响。目前应用比较广泛的pET [24]和 pQE 载体系统[25]调控紧密,其重组基因的表达水平均较高。
     
    4.2 真核细胞表达
    近年来,已有数种防御素在酵母系统中成功表达[26]。研究表明,防御素在酿酒酵母中的表达水平较低[27],而选用毕赤巴斯德酵母则可获得高效表达,其表达水平可高达70 mg/L,且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性[28]。但目前酵母系统在防御素工业开发中尚面临着一些主要问题:①应用较多的 pPIC9K 等表达载体均利用 α 因子信号肽将目的肽分泌出胞外,但常出现因信号肽酶切割效率低而导致目的肽氨基端多出数个氨基酸;②重组子表型同外源基因整合的拷贝数和高表达特性尚不一定对应,有待建立更好的挑选高效表达阳性重组子的方案;③防御素在表达和纯化过程中易被降解;④如何避免目的肽在表达过程中不进行可能会影响其结构与活性的无关修饰等。尽管如此,随着更多、更好的表达载体与工程菌株的开发和发酵工艺的发展,酵母必将可能成为防御素工业开发的表达系统。
     
    5 展望
    由于传统抗生素的毒副作用及耐药菌株的出现,人们正在努力寻找抗生素的替代品。防御素作为一种新型的生物活性肽,其抗菌谱广泛,与抗生素阻断大分子生物合成的作用机制完全不同,防御素能够快速杀灭广谱病原微生物,而且作为机体本身的一种活性物质,相对不具有免疫原性,对其具有抵抗性的细菌较少,病原菌也不易对其产生耐药性,因此可以替代抗生素发挥广谱高效的抗菌作用。但目前关于防御素生物学功能的研究还多为体外实验,
     
    这些实验只有在转化为动物模型的体内研究后,才能反映防御素在人类疾病发生、发展中的作用。而防御素家族新成员θ-防御素的发现在一定程度上也弥补了 α-防御素和 β-防御素的不足,但现今对 θ-防御素的研究还只是初步阶段,使其成为新一代抗菌药物还需进一步深入研究。另外,如何加强防御素对正常细胞的识别、降低其细胞毒性及剂量的选择等也都是防御素用于肿瘤治疗前必须解决的问题。尽管防御素的研究工作还存在着种种困难,但随着生物技术的飞速发展、新防御素基因的不断涌现、防御素家族研究的不断深入、高效表达系统和生物反应器的不断更新,我们相信防御素必将作为新一代抗菌药物走入我们的生活,为人类创造更多的价值。
     
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    作者:刘媛媛,赵宝华
    作者单位:050016 石家庄,河北师范大学生命科学学院
    通讯作者:赵宝华,Email:zhaobaohua86178@sohu.com
    收稿日期:2009-02-01