β-防御素的合成及构效关系

    发布时间: 2010-07-24 15:02 浏览次数:

    发布者:李咏兰1 曹贵方1* 邱广亮2  发布时间:2006-12-31 10:18:00

    内容摘要
    防御素属于抗菌肽中的一大家族, 从植物、昆虫到动物均有表达。β-防御素含多个二硫键,在先天免疫系统中发挥重要作用,除抗菌活性外,还具有其它重要的生物学功能,如抗病毒作用,与受体、趋化因子相互作用等。防御素的广谱活性使其成为免疫学研究热点。本文摘要了β-防御素合成、结构特征和构效关系方面的最新研究进展。
    正文
    关键词:β-防御素 免疫系统,多功能活性肽
    Synthesis and structure–activity relationship of β-defensins, multi-functional peptides of the immune system Li Yong-lan1, Cao Gui-fang1, Qiu Guang-liang2
    (1. College of animal science and animal medicine, Inner Mongolia Agricultural University, China; 2. Research Center of Biotechnology, Inner Mongolia Normal University, Huhehaot, 010022, China)
    Abstract: β-defensins are a large family of antimicrobial peptides containing multiple disulfide-bonded in mammals and birds. They play an important part in the innate immune system, directly killing microbial organisms. Recent research has showed that β-defensins are important for other biological functions beyond antimicrobial effects, including inhibition of viral infection, interaction with receptors, chemotactic effects, and sperm function. The corresponding broad spectrum of activities makes this peptide class an important subject and tool in immunologic research. In this review, we summarize the current status of the routes to obtain synthetic β-defensins, their major structural properties and structure–activity relationship.
     
    作者简介:李咏兰(1963-),女(汉族),在读博士,内蒙古师范大学生物工程研究中心,副教授,主要从事生化与分子生物学方面的研究,发表论文多篇。
    多细胞生物的免疫系统含有很多活性肽,它们保护机体免受各种微生物(细菌、真菌和古菌)和病毒的侵害。近20 年来,已发现120 余种抗菌肽。防御素属于其中的一大家族,在自然界分布广泛,从脊椎动物、昆虫和植物中已分离到多种防御素,一般含有30~50个氨基酸残基,具有多个二硫键。防御素按结构分为α-防御素、β-防御素两种亚型,α- 防御素主要由中性粒细胞和小肠潘氏细胞产生,而β-防御素广泛表达于多种器官的上皮细胞和粘膜下腺体。β-防御素具有广谱高效的抗微生物作用,分布于机体抵御病原微生物入侵的第一道防线,在使机体免受外界微生物侵袭中起着重要的作用。β-防御素的一般结构特征:分子中含有6个半胱氨酸残基,半胱氨酸分子间具有特定的间隔,形成3对二硫键,二硫键形成方式:Cys1-Cys5, Cys2-Cys4, Cys3-Cys6。
    β-防御素最早综述于1993年[1]。从牛嗜中性粒细胞、人血液超滤物和牛皮癣患者中先后分离出牛β-防御素[1]、人类β-防御素HBD-3〔2〕和(HBD-2[3,4])。研究表明成人的心脏、骨骼肌、肠腺、胎盘中均可表达β-防御素,但上皮细胞中β-防御素的表达占绝对优势。防御素的表达有些是组成型的(如HBD-1[5]),而另一些属于诱导型,如感染脂多糖和细菌可诱导产生HBD-2和HBD-3;鼠β-防御素(MBD-2, MBD-3, MBD-6[6])也属于诱导型表达,在鼠的食道、舌、气管和其它组织中均检测到了MBD的mRNA[7。β-防御素和其它抗菌肽一样,起初被认为是先天免疫系统的组分,直接破坏细菌细胞膜,并提出了抗菌肽同细菌细胞壁相互作用的几种模型,如桶-板和地毯模型[8]。显然,β-防御素的一级结构、电荷、亲水性和空间构象决定了其与细胞壁的相互作用模式。
     
    大量证据表明β-防御素除抗菌活性外还具有多种生物学功能(如图1)。如β-防御素(HBD-1,HBD-2)通过趋化作用经由趋化因子受体(CCR6)对树突细胞和T细胞发挥适应性免疫应答作用;β-防御素(HBD-2)还可以对单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞发挥细胞因子作用[9,14]。MBD-2通过受体激活树突细胞。HBD-2、HBD-3可抑制HIV-1的复制。β-防御素专一性地在胎盘中大量表达[6,15,26]。有报道表明鼠β-防御素在精子成熟中起作用。由于β-防御素具有多种生物学功能,因而此类多肽家族的研究日益受到重视。本文综述了β-防御素的化学合成、结构及构象-功能关系的最新研究进展。
     
    1. 一级结构
    迄今为止,在各种哺乳动物(灵长类动物, 啮齿动物, 有蹄类动物)和鸟类中共发现了50余种β-防御素(见表1),它们属于进化上古老的一类抗菌肽[3]。有些β-防御素基因顺序是由分离自不同组织的多肽测序后得到,如皮肤中的HBD-2[5]、HBD-3[4], 血浆HBD-1[2],牛中性粒细胞中的BNBDs[1], 舌抗菌肽[6,7], 气管抗菌肽TAP[6,7], 胃spheniscins [5,8]。另一些β-防御素序列是由相应cDNA序列克隆后测序推导而来。人类和鼠类基因组系统分析表明大量基因编码一些β-防御素多肽[5,6], 如编码HBD-1、HBD-2和HBD-3的基因成簇排列于8号染色体上,大多数新鉴定的基因位于6号和20号染色体上(如鼠类位于1,2,8和14号染色体)。表1包括了HBD-27 (基因:DEFB127)和HBD-28(DEFB128), 它们来源于20号染色体,其编码的防御素已被合成出来并进行了性质研究[9]。
     
    β-防御素一级结构中最引人注目的特性是其氨基酸顺序和组成的多样性。β-防御素属于阳离子多肽,其长度为35~50个氨基酸,其中8个残基高度保守的,6个Cys残基形成3对分子内二硫键,Cys间的间隔长度有所变化。另外两个保守残基的第一个残基为Gly,位于N端第二个Cys的上游相隔一个氨基酸残基位置,表1中仅有3种β-防御素的Gly残基被Ala所取代(HBD-2, HBD-4);第二个Gly保守残基位于第四个Cys残基间隔一个残基位置处,表1仅发现GPV-1和新发现的人类β-防御素的HBD-27和HBD-28中此处的保守Gly残基分别被Ala和异亮氨酸所取代,大多数新发现的人类β-防御素在此位置的氨基酸有所变化[5,6]。
     
    虽然在不同β-防御素中氨基酸组成变化很大,但存在一些共同特征。带正电荷的氨基酸通常簇集在C末端,在第3个和第4个Cys残基附近存在脯氨酸残基,此点对于β-转角的形成可能很重要[7]。新鉴定的大多数β-防御素基因产物(如HBD-3和HBD-4)的序列在距C末端第3个Cys残基前相隔4个残基处通常为谷氨酸,该特点区别于其它β-防御素[8]。从基因序列不能准确预测β-防御素的长度,HBD-4或新的人类β-防御素的C末端较长, 可能存在未知功能。
     
    与β-防御素非常相似的另外一种抗菌肽是从马蹄形阴虱的血细胞中分离得到,其长度为79个氨基酸残基,含6个半胱氨酸残基,形成典型β-防御素二硫桥图样[9]。与β-防御素相似的另一大类多肽是各种毒素,防御素类似肽DLP-1和DLP-2分离自鸭嘴兽毒液, 含有6个Cys,但没有抗菌活性,因为其不带电荷[10]。此外,象响尾蛇胺或洋地黄毒苷类毒素在大小、净电荷、二硫键方面均与β-防御素极其相似[11]。
     
    根据多肽和基因的长度及序列同源性,β-防御素被分为三类:(1)第一类β-防御素是一类含有63-64个氨基酸残基的较短的前原肽,从基因水平看,β-防御素的两个外显子间存在约1.6 kb的较短的内含子,这类β-防御素包括哺乳动物β-防御素:如HBD-2、MBD-3、TAP、LAP、肠道PBD-1、兔RBD-2、山羊GBD-1和GBD-2。 (2)第二类β-防御素含有较长的前原肽(68~69个氨基酸残基),具有较长的内含子(6.5 kb),包括:HBD-1、MBD-1、MBD-2和RBD-1。(3)第三类的代表是鸟类β-防御素,根据序列同源性被分为2个亚群。 a亚群包括:Gal-1、Gal-1α、Gal-3、火鸡嗜异性粒细胞多肽的THP-1、GUP-1和spheniscins; b亚群包括: Gal-2、THP-2和ostricacin-1(OSP-1)。进化关系分析支持上述分类[12,13,14,15]。
    表1 不同来源的β-防御素的氨基酸顺序
     
    2. 二级结构和三级结构
    β-防御素家族的重要参数是Cys残基的分子内分布和二硫桥图样。β-防御素二硫键连接方式是: Cys1-Cys5, Cys2-Cys4, Cys3-Cys6。牛BNBD-12采用胰酶消化和Edman降解,首次确定了其二硫键连接方式[16]。因为有关天然β-防御素二硫桥图样研究很少,通常假设所有β-防御素都具有类似于BNBD-12样的二硫桥结构模式。最近通过对天然和合成肽的对比研究证实了HBD-2的二硫桥连接方式[17]。在β-防御素类多肽群中,马蹄形阴虱的β-防御素和洋地黄毒苷类A也显示有β-防御素的二硫桥图样。三对二硫键对于稳定β-防御素空间构象具有重要的意义。采用核磁共振技术在1995年第一次确定了牛BNBD-12的结构,随后又分析了几种其它β-防御素。图2显示了七种β-防御素的三维构象,并且同两种β-防御素类毒素DCP-1和响尾蛇胺类及三种类型防御素(α-防御素、昆虫防御素和植物防御素)进行了比较。
     
    β-防御素的空间构象主要由三条反平行β-折叠片构成,且N末端具有形成α-螺旋的趋势,螺旋长度和规律性决定于实验条件,且晶体状态结构不同于溶液状态。还未搞清α-螺旋的形成与某些特定氨基酸的存在是否相关(如HBD-2 的N末端的Asp4[18])。分子内二硫键的存在降低了分子的柔性,二硫键Cys1-Cys5将α-螺旋连接到第三条β-折叠片上,二硫键Cys2-Cys4将β-折叠片1和折叠片2相连,二硫键Cys3-Cys6将β-折叠片1和折叠片2间形成的环与第三条β-折叠片连接起来。有趣的是,β-防御素与其它类型防御素折叠具有很多相似之处,哺乳动物α-防御素也存在相似的三股β-折叠片,但没有N末端α-螺旋,这可能是因为其肽链较短之故。这种三级结构上的相似性主要在于二硫键,但半胱氨酸间间隔又区别了不同类型的β-防御素。β-防御素与昆虫防御素和植物防御素间相似性较低,虽然二级结构元件是相似的(α-螺旋和两个或三个β-折叠片),但它们的空间排列和整体结构是不同的。 有趣的是,β-防御素的三级结构与鼠类或人类ccL120/MIP-3α类趋化因子极其相似[19,20],虽然其长度大于β-防御素约70个氨基酸残基,这些多肽也具有相似的正电特性,并且也具有抗菌活性[21]。此外,β-防御素通过趋化因子受体CCR6发挥趋化作用[14,22],这些趋化因子的三级结构是由一个反平行的三股β-折叠片和一个C末端α-螺旋构成。
     
    阳离子抗菌肽的作用机制大多认为:通过分子装配形成孔道,插入细胞膜[8]。就抗菌活性而言, β-防御素显示寡聚倾向, 但亚基形成寡聚体的机制和空间排列对于不同多肽变化较大, 如HBD-2通过第一条链间疏水作用聚合成二聚体[18], 而HBD-3可能通过第一条链上的Glu、Lys和Gln残基及Arg和Gln间盐键结合成二聚体[19]。通过比较缺乏这些氨基酸残基的猴β-防御素, 说明这些残基对于HBD-3的聚合非常重要[23]。
     
    3. 合成方法
    为了开发出用于β-防御素合成的专门方法, 对几种不同方法进行评价。采用Boc和Fmoc化学方法对含巯基前体的β-防御素进行了链的装配,发现某些β-防御素依赖于靶区氨基酸序列的固相装配比其它防御素更为简单[24]。下面详细讨论β-防御素二硫键形成的不同位置半胱氨酸的修饰方法。
     
    3.1 6-巯基前体的氧化性折叠:
    β-防御素中(Cys1-Cys5, Cys2-Cys4, Cys3-Cys6)3对二硫键形成的直接方法是6-巯基前体肽的氧化(见图3), 例如采用二甲基亚砜(DMSO) 氧化形成二硫桥, 此反应已用于HBD-1、HBD-2、HBD-27、MBD-7、MBD-8、BNBD-2、BNBD-12的合成[10,22,25]。在氧化折叠过程,这些多肽巯基前体能产生我们所需要的二硫键异构体作为主要产物。在某些情况下,折叠条件的优化诸如Cys∕Cys、温度或其它反应条件对抑制非β-防御素异构体的形成很重要。但是采用氧化折叠法不能合成HBD-3、HBD-23和HBD-28。在某些情况下,形成各种二硫键异构体及其它一些副产物,因为在氧化折叠反应中形成的主产物并不一定存在我们所需要的二硫键配对方式,因此在β-防御素合成中二硫键连键方式的确定尤为重要。为了确定二硫键连键方式,通常采用蛋白酶消化氧化后的多肽,保留所有二硫键,随后采用CC-MS进行分析,对含Cys片断进行Edman降解分析,因此二硫键的分析较合成更费力。因为在有些情况下,如HBD-2对蛋白酶很稳定[26]。在一些条件下,二硫键的部分还原和硫烷基化被用于确定合成肽的二硫键图样[26,27]。有些β-防御素如HBD-3和HBD-27不能折叠成其天然结构[10,19],这些多肽的氧化折叠产生一个含有全部氧化型异构体混合物。
     
    3.2 二硫键的半选择性合成
    在含3个或多个二硫键多肽合成中为了减少产物复杂性,某些基团用于选择性保护一对半胱氨酸[27]。在这些方法中,采用Trt (三苯甲基)保护2、3、4、6号半胱氨酸,剩下的两个半胱氨酸残基(1、5号)采用Acm(乙胺甲基)保护。在第一步氧化过程中,Trt保护的半胱氨酸巯基还原后再转化为两对二硫键, 形成3种二硫键异构体的混合物,采用高效液相色谱分离异构体,水解确定二硫键位置, 最后I2氧化Acm保护的半胱氨酸巯基,形成第三对二硫键,吴等人采用此种方法合成了HBD-3二硫键异构体(见图4)[10]。他们使用Acm保护1、5-cys残基,从树脂上裂解后,碱性条件下被氧化,分离后得到三种不同二硫键异构体,酶解产物后,确定二硫键连接方式。第二步氧化阶段,在酸性条件下,用I2氧化形成第三对二硫键,产生HBD-3异构体,此种方法由于产生的异构体数量少,且通过HPLC能分离开,因而有一定优越性,但就β-防御素产量而言,半选择性方法也不是最合适的方法。
     
    采用三种不同的保护基,实现半胱氨酸的不同保护, 通过顺序氧化实现二硫键的顺序形成,最终获得与天然二硫键相同的β-防御素。最近,有学者采用不同的Cys 保护基合成出了天然β-防御素[28]。三种保护基Trt /Acm /Tbu的联合使用非常成功(见图5和图6)。确定了每一种被保护二硫键形成的最适反应条件,发现最适反应条件取决于多肽序列。采用空气氧化法或二甲基亚砜,引入第一对二硫键(HBD-2,HBD-28,HBD-3),产生含一个二硫键的β-防御素。第二步氧化。采用I2氧化法氧化Acm保护的半胱氨酸残基,引入第二对二硫键后,被tBu保护的二个半胱氨酸残基的氧化需选择不同反应条件,才能合成出三种β-防御素,如HBD-2在37oC、多肽浓度0.1mg/ml条件下被合成出来,而HBD-28需要将温度升至60oC,多肽浓度降至0.05mg/ml,主要副反应是形成过氧化物,这可能是由于高浓度的3-氟乙酸(TFA)和DMSO所致。本研究采用的另一种保护剂是4-MeBn,此种保护剂的最大优点是稳定性好,需在高温下去除保护基。Cuthbertson等人采用4-MEBN用于含三个二硫键多肽的合成(如conotoxins 和enterotosin ST)[27,28]。
     
    采用合适的半胱氨酸保护方法可以制备出β-防御素,但多肽的长度、二硫键的位置和氨基酸序列对反应影响很大。近来,对表达后的新型HBD-23的合成进行了研究,HBD-23系列是从cDNA序列推导而来,实验发现采用Acm保护半胱氨酸的半选择性保护方法成功制备出了HBD-23,而不同保护基保护方法(如Trt / Acm / Tbu)未制备出天然HBD-23,原因在于去除Tbu基的氧化均导致HBD-23的过氧化,过氧化主要发生在半胱氨酸和色氨酸残基上。
     
    文献追踪显示,还没有一个通用的方法用来成功合成所有β-防御素。有些防御素能被折叠成天然二硫键图样,另一些则不能。化学合成β-防御素一般为5mg级范围,特殊情况下产量可达25mg。
    除人类如灵长类β-防御素[19]、BNDB-12[12]、DLP-1[14]、防御素相关基因CPEFR-1[29]、MBD-6[19] 和MBD-12[10]外,其它来源β-防御素的合成报道极少,这些多肽都是从6-巯基前体经氧化折叠而形成。
     
    3.3 重组表达
    一般来讲,化学合成法较重组方法合成β-防御素及其类似物更快更容易, 但是其产量低,而且二硫键形成困难且纯化复杂;而重组表达方法产量较高。在不同宿主活体内采用重组方法合成β-防御素还是一个挑战性工作,主要缺陷是低表达率,对宿主细胞蛋白酶降解高度敏感性[10,11,12,13,14],对于某些β-防御素,这些缺陷可以通过使用特定表达系统克服,在此类表达系统中多肽以高分子量的融合蛋白方式进行表达,如硫氧化还原蛋白或者将融合蛋白连接到His6-tags,通过简单的柱层析将其分离纯化[21,25]。例如HBD-1、HBD-2采用融合蛋白表达系统,这两种肽在大肠杆菌中的表达量达到mg级;将HBD-2基因连接到一个相应的多拷贝基因序列上形成一个双向表达系统[24],与单拷贝基因相比,表达率提高;有文章报道,通过替换cDNA中稀有密码子,HBD-2硫氧还蛋白融合蛋白的表达水平可大大提高,是野生型DNA的9倍。此外,细菌表达的另一个缺陷是在某些情况下,重组产生的β-防御素经常以可溶性和不溶性细菌提取物片断出现。值得注意的是,重组表达型多肽的二硫键连键方式大多未进行报道。Cipalcova等人发现重组表达型多肽的二硫键HBD-1较天然HBD-1抗菌活性低,这可能是由于HBD-1错误折叠所致。
     
    4 结构-功能关系
    迄今为止,关于β-防御素结构和生物学活性之间关系的报道很少。表2概要了一些合成型β-防御素结构变化与抗菌活性间的关系,此种结构改变或是人为造成的[10,19]或是天然突变所致[30]。最有用的结构常数是二硫键的连键方式、氨基酸的置换及多肽长度、电荷和疏水性。
     
    表2 β-防御素构效关系研究
    有报道表明结构决定了其细胞毒和趋化作用。就β-防御素抗菌活性而言,很多研究结果支持被人们广泛接受的阳离子抗菌肽活性机制模型[8,26]。BNBD-2,BNBD-12和人HBD-3的研究表明,二硫键的存在和分布对其活性并非必需,这些实验发现: 二硫键连键方式不同的几种β-防御素,在抗菌活性上并没有显著差异。类似的研究也在HBD-1中观察到,HBD-1发生突变,仅含二个分子内二硫键,其结构不同于天然HBD-1,但其抗菌活性与天然HBD-1 相近。说明存在一个非专一性的、非受体性的介导机制,该机制被下述计算和模型所支持,被截短含不同二硫键的BNBD-2形成不同的β片层结构,显然其三维构象不同,但这些不同取代物的抗菌活性相似。
     
    与抗菌活性有关的重要分子因素是电荷和疏水性。最近研究发现牛BNBD-2的抗革兰氏阳性菌活性和BNBD-12的抗革兰氏阴性菌活性主要与多肽C末端的高度离子化有关。HBD-3研究表明,其静电荷、疏水性作用决定了其对原核和真核细胞的抗菌和细胞毒活性。多肽的静电荷主要影响其抗菌活性,而疏水性与细胞毒活性有关。因此,中等疏水性、带电少的HBD-3实际上无活性,而带有大量正电荷且有明显疏水性的多肽对两类细胞均有活性。类似研究表明:用丙氨酸或色氨酸取代所有半胱氨酸残基后的线性HBD-3类似物在低离子强度下仍显示抗菌活性,有趣的是6个色氨酸的变化仍显示抗菌活性。
     
    氨基酸的置换突变或N末端被截短,这些改变未造成电荷和疏水性的显著改变,因而对某些细菌和膜渗透作用仍有效应;但是,当肽链的截短导致衍生物电荷、疏水性降低,则β-防御素抗菌活性会急剧降低,正如HBD-3研究所示[29,30]。
     
    β-防御素抗菌活性依赖于离子种类和浓度,很多研究表明大多数β-防御素在150 mM的生理氯化钠浓度下丧失其生物活性[10,11,15,16]。抗菌活性降低主要是离子导致电荷变化所致。研究表明表明K+和Na+的效应相似,二价盐离子(如Ca2+和Mg2+)更有效;而阴离子如Cl-和SO42-对活性无影响。某些研究显示,β-防御素衍生物具有低盐敏感性,有报道描述HBD-3线性分子较二硫键连键的多肽更抗盐[126,29];HBD-3的氨基酸改变,导致净电荷增加,聚合能力降低[26,27],与天然的HBD-3相比,这些类似物显示低盐敏感性;此外,据报道共价型β-防御素二聚体比其单体更抗盐[29]。因此,在某些情况下,β-防御素在高盐条件下的抗菌活性可通过改变其结构而保留。
     
    二硫键连键模式对β-防御素趋化作用起重要作用。HBD-3的6种合成型二硫键异构体就其对单核细胞和含CCR6的HEK293细胞的趋化作用进行了研究[10],这些多肽对单核细胞趋化作用的最适浓度范围为1-10000ng/ml,对CCR6/HEK293细胞的趋化作用浓度为10-1000ng/ml,而线性类似物完全无活性。而且衍生物趋化活性随细胞类型不同而不同,含有天然二硫键的HBD-3对CCR6/HEK293细胞的趋化活性最强,非天然二硫键多肽异构体对单核细胞进攻更有效。这些结果证明了β-防御素的受体介导作用要求其具有能结合并激活受体的特定的空间构象。
    结论:
     
    在1993年对β-防御素首次综述后[1],有关β-防御素的研究报道不断涌现,这些报道包括:基因结构,不同个体中的β-防御素,β-防御素的表达和表达诱导,以及先天和获得性免疫系统中的生物学活性和功能。正如本文所述,已建立了一些β-防御素的合成和研究方法。但是由于β-防御素的制备方法所限,极大地制约了其性质研究及结构-功能关系间的研究。
     
    参考文献
    [1] Wegener HC, Aarestrup FM, Jensen LB, Hammerum AM,Bager F. Use of antimicrobial growth promoters in food animals and Enterococcus faecium resistance to theraeutic antimicrobial drugs in Europe[J]. Emerg Infect Dis 1999; 5:329 -/35.
    [2] Witte W. Medical consequences of antibiotic use in agriculture[J]. Science 1998; 279: 996-/7.
    [3] 廖伟. 人β-防御素-2研究进展[J ]. 重庆医学,2005,34(1):135-137.
    [4] Diekema DJ, Brueggemann AB, Doern GV. Antimicrobial-drug use and changes in resistance in Streptococcus pneumoniae[J]. Emerg Infect Dis,2000; 6:552-/6.
    [5] Gaynes R, Monnet D. The contribution of antibiotic use on the frequency of antibiotic resistance in hospitals[J]. Ciba Found Symp,1997; 207:47-56.
    [6] Huttner KM ,Bevins CL. Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defense[J ]. Pediatr Re, 1999, 45 (6) :785-794.
    [7] Ganz , T. Defensins : Antimicrobial peptides of vertebrates [ J]. Comptes Rendus Biologies, 2004, 327 (6) :539-549.
    [8] Hiemstra PS, Fernie2King BA, McMichael J, et al. Antimicrobial peptides: mediators of innate immunity as templates for the development of novel anti- infective and immune therapeutics [J]. Curr Pharm Des, 2004, 10(23): 2891-2905.
    [9] Bauer F,Schweimer K, Kluver E et al. Structure determination of human and murine beta2 defensins reveals structural conservation in the absence of significant sequence similarity[J]. Protein Sci, 2001, 10 (12): 2470-2479.
    [10] Niyonsaba F ,Someya A ,Hirata M ,et al. Evaluation of the effects of peptide antibiotics human beta2defensins21/ 22 and LL237 on histamine release and prostaglandin D(2) production from mast cells[J]. Eur J Immunol , 2001, 31 (4) :106621075.
    [11] Jia HP, Schutte BC, Schudy A, Linzmeier R, Guthmiller JM, Johnson GK, et al. Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach[J]. Gene 2001; 263:211–8.
    [12] Jones DE, Bevins CL. Defensin-6 mRNA in human Paneth cells: implications for antimicrobial peptides in host defense of the human bowel[J]. FEBS Lett,1993; 315:187–92.
    [13] Jones DE, Bevins CL. Paneth cells of the human small intestine express an antimicrobial peptide gene[J]. J Biol Chem,1992; 267:23216–25.
    [14] 傅荣昭,李文彬,孙勇如. 防御素的研究进展[J]. 农业生物技术学报,1996,4(12):348-353.
    [15] Lehrer RI, Ganz T. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence[J]. Curr Opin Immunol 1999; 11:23–7.
    [16] Lehrer RI, Ganz T. Endogenous vertebrate antibiotics: defensins, protegrins, and other cysteine-rich antimicrobial peptides[J]. Ann N Y Acad Sci 1996; 797:228–439.
    [17] Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells[J]. Annu Rev Immunol 1993; 11: 105–28.
    [18] Lichtenstein A, Ganz T, Selsted ME. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbit granulocytes[J]. Bolld,1986; 1407–10.
    [19] Linzmeier R, Michaelson D, Liu L, Ganz T. The structure of neutrophil defensin genes[J]. FEBS Lett,1993; 321:267–73.
    [20] Bos JD, Kapsenberg ML. The skin immune system (SIS): Its cellular constituents and their interactions[J]. Immunol Today,1986; 7:235–40.
    [21] Streilein JW. Lymphocyte traffic T-cell malignancies and the skin[J]. J Invest Dermatol,1978; 71:167–71.
    [22] Streilein JW. Skin-associated lymphoid tissues (SALT): Origins and functions[J]. J Invest Dermatol,1983;80:12–16.
    [23] Bos JD, Zonneveld I, Das PK, et al. The skin immune system (SIS): Distribution and immunophenotype of lymphocyte subpopulations in normal human skin[J]. J Invest Dermatol, 1987; 88:569–73.
    [24] Bos JD, Kapsenberg ML. The skin immune system: Progress in cutaneous biology[J]. Immunol Today,1993; 14: 75–8.
    [25] Das PK. Immune response in mycobacterioses related to dermatoses[M]. In: Orfanos GE, Stadler R, Gollnick H, editors. Dermatology in five continents. Berlin: Springer, 1988:778–81.
    [26] Pereira LS, Oliveira PL, Barja-Fidalgo C. Production of reactive oxygen species by hemocytes from the cattle tick Boophilus microplus[J]. Exp Parasitol,2001; 99: 66–72.
    [27] Ehret-Sabatier L, Loew D, Goyffon M. Characterization of novel cysteine-rich antimicrobial peptides from scorpion blood[J]. J Biol Chem,1996;271:29537–44.
    [28] Hubert F, Noel T, Roch PA. A member of the arthropod defensin family from edible Mediterranean mussels (Mytilus galloprovincialis) [J]. Eur J Biochem,1996; 240:302–6.
    [29] Bulet P, Cociancich S, Reuland M. A novel insect defensin mediates the inducible antibacterial activity in larvae of the dragonfly Aeschna cyanea (Paleoptera Odonata) [J]. Eur J Biochem, 1992; 209:977–84.
    [30] Rees JA, Moniatte M, Bulet P. Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea) [J]. Insect Biochem Mol Biol,1997; 27: 413–22.