猪β-防御素的研究进展及其应用前景

    发布时间: 2010-07-24 14:58 浏览次数:

    金海丽 许梓荣
    (浙江大学动物科学学院饲料所,浙江杭州310029)
     
      防御素是生物界广泛存在的一类具微生物抗性的低分子肽,其中哺乳动物防御素的抗谱最广,具有很高的应用潜力。本文概述了猪β-防御素的分布、立体结构、基因表达调控的研究进展,并展望了其在畜牧业中的应用前景。
     关键词 猪;防御素;研究进展
     中图分类号;S816.79 文献标识码:A 文章编号:1004-0084(2002)11-07-02
           人与动物之所以对病原微生物具有抵抗力是机体具有内在防御系统。在病原体的侵染诱导下,生物机体自身会产生系列的拮抗物质,以阻止病害的传播和病原微生物的进一步入侵。
            防御素(defensin)就是生物体抵御病原体的防御反应过程中产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽,它既可亲水也可亲脂,能与细胞膜的磷脂结合,破坏细胞膜,从而杀伤微生物。体外实验表明它具有十分广泛的抗菌谱,可以抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物,尤其是哺乳动物防御素除了对细菌。真菌、被膜病毒有毒杀作用外,还对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞有杀伤作用。随着耐药细菌。真菌和寄生虫的出现,人们越来越重视内源性的抗微生物肽,以代替普通的抗生素使病原微生物不易对其产生抗性。因此哺乳动物防御素在医药开发或是植物抗病育种中都具有广泛应用前景和更高的应用价值,在畜牧领域中也会日益受到关注。
            哺乳动物防御素根据氨基酸序列和结构的不同可将其分为α一防御素和β一防御素。猪β一防御素。猪β-防御素(pBD-1)是新发现的一种β一防御素,在猪防御系统中有重要作用。
    1 猪β-防御素(pBD-1)的结构及分布
            β-防御素是一种富含半胱氨酸阳离子多肽,含有 6个稳定的半胱氨酸,分别以 l-6,2-4,3一5连接形成三个分子的二硫键,构成稳定的反相平行的三股β一片层结构。二流键可以使小分子防御素紧密联结以防御蛋白酶水解,所以在富含蛋白的吞噬溶酶体环境中仍能保持其特性,这也是防御素区别与其他抗微生物肽的主要因素。pBD-1除上述结构外,还含有2个精氨酸、7个赖氨酸,且在成熟的肽中不含有阴离子残基。
            Zhang等通过反转录扩增(RT-PCR)发现,猪的β防御素pBD-lmRNA几乎是无处不在的,它广泛分布于胸腺、脾、肝、肾、淋巴结、膀胱、脑、睾丸、肌肉、皮肤、骨髓、心脏等器官的组织细胞中,DNA印迹结果表明,在猪舌中防御素的含量最多可达20-100mg/L。
            pBD-l重组体具有很强的抗细菌活性,可以抑制大肠杆菌(Escherwhia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和李斯特单胞基因菌(Listeria monocytogenes)等,同时可与来自中性粒细胞的其它抗微生物肽协同杀死细菌。但到目前为止还未发现pBD-l对病毒有作用的报道。
            对其作用机制响两种观点,一种观点是Lehver等将防御素对微生物的杀伤作用分为三个步骤:第一阶段,防御素被细胞膜上某些位点所带的静电吸附;第二阶段,在膜电势差的影响下,防御素单体或双体分子进入带电的细胞膜,破坏其完整性,这个过程可能形成受电势调节的孔洞;第三阶段,如果上述的损伤未被及时修复或除去,则细胞膜发生不可逆的损伤,从而使防御素和外环境中多种物质与水分进入靶细胞,同时靶细胞中的物质泄漏,最终导致细胞被破坏。
            另一种观点是细菌和哺乳动物细胞膜与防御素发生的变化分为两相。第一相是防御素介导出现细胞膜的通透性;第二相是防御素进入细胞从而导致死亡。第一相在防御素介导的细胞死亡过程中是必要的,但需有第二相的继续,否则细胞变化仍可逆转。干扰能量代谢或降低膜两侧电动势可抑制第一相,而干扰蛋白合成的因素(防线菌酮或防线菌素B)可增加第二组。
    3 pBD-1的基因表达调控β一防御素的表达既有组成型的,又有诱导型的。根据基因结构、分布、长度、氨基酸序列的同源性和表达调控的方式不同可将β一防御素分为两类。一类包含68-69个氨基酸前体肽,主要在生殖泌尿系统中表达,对炎症诱导介质无明显反应。另一类前体肽的氨基酸序列较短,只含5-6个氨基酸残基,多在各种上皮细胞进行表达,如牛呼吸道抗生物肽(TAP)等。这类β一防御素在炎症诱导介质如脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的作用下,呈诱导型表达。
            据氨基酸和核苷酸序列的保守性,可将pBD-1归类于第二种β一防御素,即其归属于TAP类,但研究人员发现pBD-l基因在感染和传染时期其表达并没有改变。用猪舌的上皮细胞做培养试验,当用LPS、TNF-α和白介素一l(IL-1)刺激该细胞时,PBD-l mRNA的含量无变化;检测经沙门氏杆菌感染两天的细胞,发现PBD-l mRNA并未增加。这说明PBD-l并不受前炎因子LPS、TNF-α和 IL-l的正向调控。
            同时又有人发现,通过转染pBD-l启动子到NTH/3T3;纤维原细胞内,基因的活性也不再受到LPS、TNF-α和IL-1的影响。在比较pBD-1和其它诱导型的β一防御素核心启动子序列时发现,pBD-1存在保守的真核基因启动子的TATA框,但是核心因子(NF)-kB和NF-IL-6的核苷酸识别位点缺乏同源保守性,这可能就是pBD-l不受前炎因子调控的原因。
    4    Pbd-1的应用前景
            抗微生物多肽,是非特异性免疫重要组分,防御素作为其关键成分之一,与其他抗微生物多肽相比具有特殊的抗病性机理。它主要作用于病原微生物的细胞膜,使病原微生物不易对其产生抗性,而其他执微生物肽主要作用于微生物的酶,酶基因的突变会使靶细胞对其产生抗性,因此防御素具有其他抗微生物肽无可比拟的优势。尤其现在很多抗生素的毒副作用,多种微生物的抗药性以及外源物质的潜在危险,加速了人们对防御素的研究和开发。
            pBD-1是广泛存在于猪体的一种β一防御素,其表达受发育阶段的调控,这有别与其它TAP类的防御素。这种调控方式有可能在维持粘膜表面做生物群落的稳定中有着重要监护作用。而且pBD-l又有相对广泛的抗菌谱,因此在应用上有一定的前景,但其对猪或其它动物的作用效果还需试验来证实,对于pBD-1对其它动物的作用是否相同也需证明。因此pBD-1在畜牧中的应用和推广还需进行深入研究。